今天是:
欢迎来到中医白血病网,专业治疗急性白血病,慢性白血病,祝白血病患者早日康复!
设为首页 加入收藏
白血病康复
联系我们

医院名称:无极县红十字会血康医院
地址:河北省石家庄无极城北工业区袁流村
河北省无极县无繁线204省道袁流村站下车即到。
    为了方便患者就诊,我院在石家庄火车站停车广场设有两部专车免费接送。
    司机师傅电话:13171806795 15931183533

    无极车站接站司机师傅电话:15231175981
    :请认准无极血康医院字样。

当前位置:白血病治疗网 >> 白血病常识 >> 白血病答疑 >> 浏览文章

TRIP13基因mRNA在慢性淋巴细胞白血病B淋巴细胞的表达及其调控JVM-2细胞增殖和凋亡的分子机制探讨

作者:佚名 日期:2017年10月14日 来源:本站原创 浏览:

核心提示:TRIP13基因mRNA在慢性淋巴细胞白血病B淋巴细胞的表达及其调控JVM-2细胞增殖和凋亡的分子机制探讨甲状腺激素受体相互作用分子13(thyroidhormonereceptorinteractor13,TRIP13)是最早在小鼠中发现的一种有丝分裂检查点相

  TRIP13基因mRNA在慢性淋巴细胞白血病B淋巴细胞的表达及其调控JVM-2细胞增殖和凋亡的分子机制探讨

  甲状腺激素受体相互作用分子13(thyroid hormone receptor interactor 13,TRIP13)是最早在小鼠中发现的一种有丝分裂检查点相关蛋白(pachytene checkpoint 2),是一种AAA+ ATP酶,在小鼠、酵母及线虫细胞中主要发挥细胞周期检查点的功能[1,2,3,4]。近年来TRIP13和人类肿瘤的关系正在引起关注。TRIP13能够促进头颈部肿瘤细胞DNA损伤修复,从而介导肿瘤细胞对化疗及放疗耐受[5]。联合分析TRIP13和前列腺特异性抗原(PSA)表达可以更精确地诊断前列腺癌[6]。此外,在非小细胞肺癌中TRIP13基因DNA拷贝数发生了明显改变[7]。本研究中,我们应用实时荧光定量PCR检测慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者外周血CD19+ B淋巴细胞TRIP13 mRNA的表达水平,从细胞水平探讨TRIP13干扰对CLL细胞系JVM-2增殖和凋亡的调控作用及其分子机制。

  材料与方法

  1.标本来源及制备:

  本研究纳入2014年3月1日至2015年10月31日期间河南省肿瘤医院收治的30例初诊CLL患者。男18例,女12例,中位年龄61(52~79)岁,外周血中位WBC 78.64(31.93~252.46)×109/L,中位淋巴细胞比例0.76(0.56~0.98)。以12名造血干细胞供者作为正常对照组。采集CLL患者及正常对照组外周血标本,常规分离单个核细胞并应用CD19磁珠(德国美天旎公司产品)分选CD19+ B淋巴细胞。本研究经医院伦理委员会审核批准,受试者均知情同意。

  2.细胞株:

  B细胞来源CLL细胞系JVM-2购自American Type Culture Collection细胞库,使用含10%胎牛血清的DMEM培养基(美国Gibco公司产品),在37 ℃、5% CO2、相对湿度95%条件下培养。

  3.实时荧光定量PCR检测外周血B淋巴细胞TRIP13 mRNA表达:

  反应体系参照SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒(日本TaKaRa公司产品)说明书配制。反应条件:95 ℃ 10 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s(39个循环)。CLL患者和正常对照组外周血B淋巴细胞TRIP13 mRNA相对表达量用2-ΔCt法表示。

  4.Western blot法检测蛋白表达:

  用细胞蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白,行SDS-PAGE分离蛋白(90 V 30 min,120 V 1 h)。电泳结束后以电转移法将蛋白从凝胶转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5% BSA液封闭,依据膜面积计算抗体体积,分别加入TRIP13、Bcl-2、Myc、GAPDH(英国Abcam公司产品,1∶1 000)室温孵育1 h,然后再加入1∶10 000对应二抗(美国Santa Cruz公司产品)室温孵育1 h,最后将PVDF膜用ECL化学发光试剂盒(美国GE公司产品)处理并显影。蛋白表达使用化学发光法检测并通过G:BOX化学凝胶成像系统(美国Syngene公司产品)检测。实验重复3次。

  5.SiRNA慢病毒载体构建及感染:

  TRIP13干扰慢病毒载体GV115由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。培养生长状态良好的目的细胞,使用MOI=50进行正式感染。参照预实验确定的感染时间点,于荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达情况,感染率达70%~80%、细胞汇合度达80%时收集细胞进入后续实验。TRIP13的所有使用靶点分别为:5′-GAAGACATAAACCTGAGTGTT-3′,5′-GACATAAACCTGAGTGTTAGA-3′和5′-TACTCAACAGACATAATAT-3′。有效干扰靶点序列为5′-TACTCAACAGACATAATAT-3′,对照序列为5′-GCCTAACTGTGTCAGAAGGAA-3′。

  6.MTT比色法检测JVM-2细胞增殖能力:

  取对数生长期JVM-2细胞,使用TRIP13干扰对照慢病毒感染后接种于96孔板(每孔200 μl),分别培养1、2、3、4、5 d后加入5 mg/ml MTT 20 μl,继续培养4 h,弃上清,每孔加入150 μl DMSO,振荡10~ 20 min充分溶解结晶后,用酶标仪于490 nm测定每孔的吸光度(A)值。实验重复3次。

  7.流式细胞术检测JVM-2细胞凋亡:

  用冷PBS缓冲液洗涤JVM-2细胞2次,3 000 r/min离心2 min(离心半径8 cm),弃上清,加入490 μl预冷结合缓冲液重悬细胞(细胞密度为1×105/ml~1×106/ml),再加入5 μl Annexin Ⅴ-APC和5 μl PI于细胞悬浮液中,轻轻混匀并将试管置于冰上,避光培养10 min,上机检测。

  8.统计学处理:

  采用GraphPad Prism 5.0统计软件进行数据分析,计量资料均用单样本K-S法进行正态性检验且符合正态分布,采用

  ±s表示,多组间与组内多指标比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,非成对样本比较采用U检验。P<0.05为差异有统计学意义。

  结果

  1.实时荧光定量PCR检测CLL患者外周血B细胞TRIP13 mRNA表达:

  30例CLL患者B细胞TRIP13基因mRNA的表达(2-△Ct=0.014 89)高于正常对照组(2-△Ct=0.000 19)(P<0.001),提示TRIP13高表达可能和CLL的发病相关。

  2.JVM-2细胞有效TRIP13干扰靶点的筛选:

  使用对照慢病毒摸索JVM-2细胞的感染条件,为了确定慢病毒的感染效率,所有使用的慢病毒载体均携带EGFP。如图1所示,荧光显微镜下在MOI=50时JVM-2细胞的感染率>90%,适合进行后续实验。

  图1JVM-2细胞的慢病毒感染效率针对人源TRIP13的CDS区域序列寻找适合的siRNA干扰靶点作用区域。一共设计了3条siRNA序列:5′-GAAGACATAAACCTGAGTGTT-3′、5′-GACATAAACCTGAGTGTTAGA-3′和5′-TACTCAACAGACATAATAT-3′。分别标记为干扰1、干扰2、干扰3。通过Western blot实验发现,3个靶点在JVM-2细胞中都能够一定程度地下调TRIP13的蛋白表达,且3号干扰靶点在JVM-2细胞中的蛋白敲减效率最高(图2),因此选择3号靶点进入后续实验。

  图2TRIP13的3个干扰靶点在JVM-2细胞中的蛋白水平敲减效率比较3.MTT比色法检测TRIP13干扰对JVM-2细胞增殖的影响:

  使用最佳干扰靶点处理JVM-2细胞后应用MTT比色法检测TRIP13干扰病毒及对照病毒感染5 d内两组细胞的增殖活性,结果显示,TRIP13干扰慢病毒感染后JVM-2细胞的增殖活性较对照组显著下降(P<0.05)(图3)。

  图3MTT比色法检测TRIP13干扰对JVM-2细胞增殖的影响(n=3;aP<0.01;bP<0.001)4.流式细胞术检测TRIP13对JVM-2细胞凋亡的影响:

  由于慢病毒载体携带EGFP标签,因此使用Annexin Ⅴ-APC单染方法进行凋亡检测,以去除可能的EGFP荧光干扰实验结果。TRIP13干扰组JVM-2细胞凋亡率高于对照组[8.78±0.42)%对(4.95±0.69)%,t=9.730,P<0.001],提示慢病毒介导的TRIP13干扰可能通过影响细胞凋亡来调控JVM-2细胞增殖。

  5.Western blot检测TRIP13干扰对JVM-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响:

  干扰TRIP13后JVM-2细胞中Bcl-2和Myc蛋白表达下调(P<0.001),Bax、caspase3和Bad蛋白表达上调(P<0.001),详见图4。提示TRIP13能够通过调控Myc和Bcl-2家族蛋白导致JVM-2细胞产生caspase3依赖性的细胞凋亡以及细胞增殖抑制。

  图4Western blot法检测TRIP13干扰对JVM-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响讨论

  CLL是一种老年性疾病,以免疫功能不全的高分化淋巴细胞克隆性增殖为主要特征。针对CLL的新的治疗方法特别是药物作用靶点是目前研究的热点。

  TRIP13基因已被证明是一个着丝粒定位蛋白,其功能为确保细胞分裂准确进行。许多着丝粒定位蛋白在多种肿瘤中高表达,其表达量与基因组不稳定或肿瘤细胞恶性转化相关[8,9,10,11]。本研究首次发现CLL患者TRIP13基因mRNA表达高于正常人,提示TRIP13的异常高表达可能与CLL的发生发展有关。TRIP13的高表达也存在于头颈部肿瘤和前列腺癌中,表明TRIP13可在多种肿瘤中高表达,与其他着丝粒定位蛋白类似。因此,TRIP13可能是一种广谱的原癌基因[12,13,14]。

  有丝分裂异常往往导致非整倍体细胞的产生,促进细胞的遗传不稳定性和诱导细胞凋亡或恶性转化。有丝分裂需要确保着丝粒正确连接到纺锤体介导的染色体精确分布。该过程需要一个关键的蛋白复合物——有丝分裂检查点复合物(MCC),其中包含有丝分裂纺锤体检查点蛋白1(MAD1)和MAD2形成的二聚物。异常表达或功能失活的MCC和多种肿瘤的发生发展相关。MAD2或MAD1的杂合性缺失会导致小鼠的胚胎成纤维细胞出现高频率的非整倍体。这些结果表明,该复合体在肿瘤形成中发挥重要的作用[15,16,17,18]。TRIP13具有促进MCC复合体解离并抑制有丝分裂完成的作用。因此,异常高表达的TRIP13和缺失的MCC复合体具有类似的促癌作用,因为两者都可以导致有丝分裂的异常并产生非整倍体细胞。

  本研究应用慢病毒介导的shRNA干扰JVM-2细胞TRIP13表达,并应用MTT比色法和流式细胞术检测TRIP13干扰前后JVM-2细胞的增殖和凋亡情况,证明了TRIP13在调控JVM-2细胞增殖和凋亡过程中所起的作用,其调控JVM-2细胞增殖凋亡的分子机制包括Myc、Bcl-2等多个信号通路。在这项研究中,我们发现了新的TRIP13促进B细胞恶性转化的机制。TRIP13干扰能够诱导Myc、Bcl-2表达下调,推测TRIP13可能通过转录调控直接影响下游各凋亡调控基因来影响CLL细胞的增殖和凋亡。深入研究TRIP13在CLL发生发展中的确切作用机制,可为TRIP13基因成为潜在的CLL药物作用靶点奠定理论基础。


上一篇文章:治疗白血病的花费
下一篇文章:现在白血病能被治愈吗?
无极县红十字血康医院,专业治疗血液病。是石家庄市新型农村合作医疗定点医院、石家庄市医疗保险定点医院。袁氏疗法中医特色治疗各类血液病,帮助血液病患者早日解除病痛。免费咨询电话:4001818958
0% (0)
0% (10)
联系我们| 网上诊室 | 网站地图 | 医院简介 | news.xml | sitemap.xml
提供白血病症状,白血病诊断,白血病治疗,白血病护理,白血病食疗,白血病预防等白血病相关知识的在线和电话咨询!
咨询电话:0311-86508999 86509285 传真:0311-86508068 86509111
石家庄火车站有接站专车,司机电话:15931183533 13171806795认准车上的血康医院字样,以防上当!!
无极县汽车站有专车接站 院长专线电话:15131128888
本站信息仅供参考,不能作为诊断以及治疗的依据 冀ICP备07501388号

冀公网安备 13013002000208号

点击这里给我发消息
点击这里给我发消息
点击这里给我发消息
点击这里给我发消息
点击这里给我发消息
点击这里给我发消息